利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀稱為分光光度計，分光光度計靈敏度高，測定速度快，應(yīng)用范圍廣，尤其是紫外/可見分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中*的基本手段之一。
1.紫外和可見光光譜
光譜
光是電磁波，可用波長”λ”表示，電磁波譜是由不同性質(zhì)的連續(xù)波長的光譜所組成，對于生物化學(xué)來說，zui重要的波長區(qū)域是可見光和紫外光。
光的波長是二個相鄰的波峰之間的間隔。光的傳播是由相互垂直的電場分量”E”和磁場分量”H”所構(gòu)成。
λ ＝ C/V
其中， λ-波長； C-光速； V-頻率，單位時間通過一個定點的波數(shù)。
光又可以看作是由具有能量的粒子所組成，這些粒子所具有的原能量”E”由下式算出：
E ＝ H·V
H-普朗克常數(shù)（ 6.624×10-27爾格·秒）； V-頻率。
紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm 波長的光，因此常規(guī)紫外測定集中在近紫外區(qū)，即 200nm～400nm?？梢姽鈪^(qū)為400nm～800nm。
組成物質(zhì)的分子均處于一定能態(tài)并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉(zhuǎn)動、振動和分子內(nèi)電子的運動，每種運動狀態(tài)都處于一定的能級，因此分子的能量可以寫成：
E＝E0 E 平 E 轉(zhuǎn) E 振 E 電
E0-分子內(nèi)在的不隨分子運動而改變的能量； E 平--平動能，只是溫度的函數(shù)因此與光譜有關(guān)的能量變化是分子的轉(zhuǎn)動能量、振動能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態(tài)，當(dāng)它吸收一定能量躍遷到激發(fā)態(tài)，則產(chǎn)生吸收光譜。分子轉(zhuǎn)動、振動和電子能級的躍遷，相應(yīng)地產(chǎn)生轉(zhuǎn)動、振動及電子光譜。
按照量子力學(xué)原理，分子能態(tài)按一定的規(guī)律跳躍式地變化，物質(zhì)在進射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續(xù)的，物質(zhì)只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關(guān)系：
E＝E2- E1＝h
E1、E2分別表示初能態(tài)和終能態(tài)的能量，初能態(tài)與終能態(tài)之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續(xù)的，因此在光的一定部位出現(xiàn)一系列吸收譜帶。由于分子轉(zhuǎn)動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現(xiàn)在不同的光譜區(qū)域。分子轉(zhuǎn)動能級級差小，△E＜0.05電子伏特（ev），分子轉(zhuǎn)動光譜的吸收出現(xiàn)在遠(yuǎn)紅外或微波區(qū)。振動能級間的差別較大， E＝0.05~1.0ev，振動光譜出現(xiàn)在中紅外區(qū)。
電子能級的級差更大， E＝1~20ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現(xiàn)在可見、紫外或波長更短的光譜區(qū)。
可見光、紫外光吸收光譜，是由于分子中較疏松的價電子被激發(fā)產(chǎn)生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態(tài)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。
與吸收光譜有關(guān)的三種是：
①二個原子的電子沿其對稱方向相互形成的共價鍵（即單鍵），稱σ 鍵， 構(gòu)成σ 鍵的電子稱σ 電子，如C－C、C－H 鍵。
②平行于二個原子軌道形成的價鍵（即雙鍵），稱π 鍵，形成π 鍵的電子稱為π 電子，如C=C 鍵。
③未共享成鍵的電子，稱n 電子。
各種電子躍遷所需能量大小的順序是：
紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π 電子和未共享的電子對的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對的共軛情況等。
表2－7 電子躍遷類型與紫外吸收波長（nm）關(guān)系
